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PCR反應各個組分和條件

發布者:莊盟生物發布時間:2015-04-09瀏覽次數:3640次

PCR反應組分

引 物

引物與模板配對的長度應至少為17個核苷酸,最高不宜超過30個核苷酸,最佳長度為20-24個核苷酸,如需插入酶切位點,應在酶切位點5'端多加幾個堿基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量組成應均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體;兩個引物中(G+C)%含量應盡量相似;引物內部應避免形成明顯的二級結構,如發夾結構;兩個引物之間不應發生互補;特別是在引物3'端最好有富有GC,這樣退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需經過色譜層析或PAGE純化,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右,濃度太高會導致非特異性擴增,太低則擴增產物太少。

模 板

模板可以是單鏈DNA,也可以是雙鏈DNA,質粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板量一般不需太多,不超過1μg為宜,因為模板量過多可能導致非特異性擴增增加,但是要考慮模板中靶序列的含量。例如:使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,就需要適當加大模板用量。

反應緩沖液

緩沖液的PH值,鹽離子濃度、助溶劑成分等都會對PCR反應產生影響。我公司提供的Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM,可以適用于大多數PCR反應,但它并非對任何模板和引物的組合都是最佳的。

酶  量

50μl反應體系可用0.5-5U酶,酶量的選擇與模板DNA的量、擴增片段大小等有關,酶量過多易發生非特異性反應,而且可能增加突變的機率,尤其在進行高保真擴增時,應盡量減少酶量,但酶量過少時反應性能會下降。


PCR反應條件

變性溫度與時間

模板變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度,達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板,PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全,DNA雙鏈會很快復性,因而減少產量。變性溫度太高,又會影響酶的活性,一般情況下可設為94℃ 20-30秒,高溫時間應盡量縮短,以保持耐熱DNA聚合酶的活力,最高變性溫度不宜超過95℃。

退火溫度與實踐

退火溫度決定PCR特異性與產量。溫度高特異性強,但過高則引物不能與模板牢固結合,DNA擴增效率下降;溫度低產量高,但過低可造成引物與模板錯配,非特異性產物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設置特定反應的最適退火溫度,可根據引物的(G+C)%含量進行推測,一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時間一般為30-60秒,足以使引物與模板之間結合,沒有必要長時間退火。

延伸溫度與時間

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間,延伸時間根據所有聚合酶擴增速度和擴增片段大小設定。如同樣擴增2kb片段,若使用Taq酶只需要1分鐘,使用Pfu酶則應設定2分鐘以上。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。時間太短則可能得不到擴增產物或得到一些短的非特異性片段。

循環次數

可根據模板DNA的量,擴增片段的大小和擴增產物的下步應用等因素,設定30-40個循環。循環次數太少,擴增量不足,如果循環次數太多,錯配幾率會增加,非特異性背景嚴重。所以,在保證產物得率的前提下,應盡量減少循環次數。


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